Protokolle

Protokoll A: Verdau von gelösten Proteinen

Trypsin (SERVA Kat.-Nr. 37283, 37284, 37284)

  • Das lyophilisierte Trypsin wird in 50 mM Essigsäure zu einer Endkonzentration von 1 µg/µl gelöst.
  • Zum Verdau des Zielproteins sollte das Verhältnis von Protease zu Protein final 1:100 bis 1:20 (w/w) betragen.

Endproteinase Glu-C (SERVA Kat.-Nr. 20986)

  • Verdaupuffer: 100 mM NH4HCO3, pH 7,8 (optional: 100 mM Tris/HCl, pH 7,8)
  • Das lyophilisierte Enzym wird in dest. Wasser zu einer Endkonzentration von 100 ng/μl gelöst.
  • Anschließend wird das Enzym mit Verdaupuffer zu einer Endkonzentration von 5 ng/μl gelöst.
    Hierzu werden 5 µl der Enzymlösung (100ng/µl) mit 95 µl Verdaupuffer versetzt.
  • Die spezifischen Volumina und Konzentrationen können an die Probenzahl bzw. -konzentration angepasst werden.
  • Das Verhältnis von Protease zu Protein sollte final 1:20 bis 1:100 betragen.

Protokoll B: In-Gel-Proteinverdau

Trypsin (SERVA Kat.-Nr. 37283, 37284, 37284)

  • Das lyophilisierte Trypsin wird in 50 mM Essigsäure zu einer Endkonzentration von 1 µg/µl gelöst.
  • Zugabe von 25 mM NH4HCO3, pH 8, um eine Trypsin-Lösung mit der Konzentration von 50 µg/ml zu erhalten.
    Zum Beispiel: 25 µl Trypsin (1 µg/µl) + 475 µl NH4HCO3, pH 8 (25 µg Trypsin/500 µl = 50 µg Trypsin/ml)
  • Für die Anwendung wird die Trypsin-Lösung (50 µg/ml) 1:2,5 mit 25 mM NH4HCO3, pH 8 verdünnt und 10 – 20 µl für Rehydratisierung bzw. den Verdau eines Gelstücks eingesetzt.

Endproteinase Glu-C (SERVA Kat.-Nr. 20986)

  • Verdaupuffer: 100 mM NH4HCO3, pH 7,8 (optional: 100 mM Tris/HCl, pH 7,8)
  • Das lyophilisierte Enzym wird in dest. Wasser zu einer Endkonzentration von 100 ng/μl gelöst.
  • 10 μl des gelösten Enzyms (100 ng/µl) werden mit 90 μl Verdaupuffer versetzt, so dass die Endkonzentration 10,0 ng/μl beträgt. Die Enzymlösung wird bis zur weiteren Verwendung auf Eis gestellt.
  • Zugabe von 50 μl der Enzymlösung (10 ng/µl) zu einem getrockneten Gelstück und 45 min Inkubation auf Eis.
  • Anschließend wird die Lösung von den Gelstücken mit Hilfe einer Pipette entfernt und durch 50 µl Verdaupuffer ersetzt.
  • Inkubation über Nacht bei 37 °C.

Peptidextraktion (Empfehlung um Verstopfung des LC-Systems zu vermeiden)

  • Lösung des In-Gel-Verdaus zentrifugieren und in ein neues Reaktionsgefäß überführen.
  • Alternativ: Extraktion der Peptide z. B. mit Essigsäure und Acetonitril.

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