Western Blotting
Für die Analyse werden Proteine meistens mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt. Eine weitere Charakterisierungsmethode bildet der anschließende Western Blot, gefolgt von einer Immundetektion. Dazu werden Proteine durch Elektrotransfer geblottet. Der Transfer kann entweder mittels Semi-dry oder Tank-Blotting erfolgen.
Semi-dry Blotting
- Erfolgt in der Regel mit einem diskontinuierlichen Puffersystem
- Für effizienten und schnellen Proteintransfer (innerhalb von 15 min): SERVA Xpress Blotting mit einem speziellen Puffersystem und Blotting Fleeces
- Ermöglicht den gleichmäßigen Transfer von großen und kleinen Proteinen
Tank Blotting
- Erfolgt in der Regel mit Towbin-Puffer
- Kleine Proteine werden schneller geblottet als große
Als Transfermembranen können sowohl Nitrocellulose (NC)- als auch PVDF-Membranen verwendet werden.
Nitrocellulose (NC) - Häufig für Routineapplikationen eingesetzt
- Bindungskapazität: 80 - 120 mg/cm2
- Geringer Hintergrund
- Geringe mechanische Stabilität, falls nicht verstärkt
- Proteinbindung ist abhängig von der Methanol-Konzentration
- Für Proteine, DNA, RNA
PVDF – Bessere Transferergebnisse als NC aufgrund der höheren Bindungskapazität
- Bindungskapazität: 125 - 250 mg/cm2
- Hydrophob
- Hohe mechanische Stabilität
- Für Proteine
Der Nachweis der Membran-gebundenen Proteine erfolgt in der Regel mit Meerrettich-Peroxidase (HRP)- oder alkalischer Phosphatase (AP)-markierten Antikörpern.
Antigen-gebundene Antikörper werden anschließend durch eine chemische Reaktion des Enzyms mit dem jeweiligen Substrat detektiert, da hierbei ein Chemilumineszenz- oder kolorimetrisches Signal entsteht.