Großformatige, horizontale 2D Gele mittels Immunodetektion zu analysieren, war bisher nicht oder nur unter sehr erschwerten Bedingungen möglich. Die Trägerfolie, die zur Stützung des Gels während aller Handlingprozesse in der 2D Gelelektrophorese notwendig ist, macht einen Semi-Dry Blot unmöglich. Das Trennen von Gelmatrix und Trägerfolie ging bisher nur durch ein mühevolles mechanisches Vorgehen, das nicht selten dazu geführt hat, dass das Gel mit den getrennten Proben mehr oder weniger zerstört wurde.
SERVA hat einen simplen Trick gefunden, dieses Dilemma zu umgehen. Bei den 2D HPE™ BlotGelen ist die Gelmatrix über einen schmalen Streifen am Rand kovalent mit der Trägerfolie verbunden, der überwiegende Teil des Gels haftet nur nicht-kovalent an der Folie. Vor dem Transfer der Proteine auf die Membran mittels Semi-Dry Western Blotting kann der kovalent gebundene Streifen abgeschnitten und das Gel mühelos von der Trägerfolie getrennt werden. Eine wichtige Anwendung des 2D Western Blots ist die Analyse von Host Cell Proteins (HCP), die damit mühelos gelingt.

Hier ein Kurzprotokoll, das die Vorgehensweise einer erfolgreichen 2D WB HCP Analyse aufzeigt:

A. HCP-Probenvorbereitung Es beginnt mit der Qualität der zu analysierenden Probe. Hier spielen viele Faktoren eine wichtige Rolle, z. B. die Wahl des richtigen Lysepuffers. Ihr Protokoll

B. Entsalzung Ein zu hoher Salzgehalt ist eine häufige Ursache für "schlechte" Ergebnisse. Hier können "X-Spinner" von SERVA helfen. X-Spinner Ultrafiltrations-Konzentratoren

C. Fluoreszierende Vormarkierung Mit SERVA SciDyes (2, 3 und 5) oder SERVA Lightning Red bietet SERVA fluoreszierende Farbstoffe zur Vormarkierung Ihrer HCP-Probe an. SERVA SciDyes, SERVA HPE™ Lightning Red

D. 2D-Elektrophorese: Isoelektrische Fokussierung (1. Dimension) & SDS PAGE (2. Dimension) Tragen Sie SERVA IPG BlueStrips für die 1. Dimension auf. Trennen Sie die Proteine in den neu entwickelten SERVA 2D HPE™ Large Format Gels (255 mm x 200 mm) für das Blotting, die nicht fest mit der Rückseitenfolie verbunden sind, auf der Flachbett-Elektrophoresekammer HPE™ BlueHorizon™. Erhalten Sie bis zu 20 % mehr Spots im Vergleich zu Standardmethoden (Literaturangabe vorhanden). SERVA IPG BlueStrips - 2D HPE™ Large Gel - HPE™ BlueHorizon™ System

E. In-Gel-Fluoreszenz-Detektion Erhalten Sie Ihr hochauflösendes Referenzmuster Ihrer HCP-Probe.

F. Semi-Dry Blotting Nach der Trennung von Gel und Back-up-Film können die Proteine durch Semi-Dry Blotting einfach und schnell auf die Membran übertragen werden. Die Handhabung ist erstaunlich einfach und die Ergebnisse sind überzeugend. Xpress Blotting Kit - BlueBlot Semi-Dry Blotter + BluePower™ 300 BLOT Power Supply

G. Fluoreszenzdetektion auf der Membran Überprüfen Sie die Transfereffizienz, indem Sie die In-Gel- und On-Membrane-Muster Ihrer HCP-Probe vergleichen.

H. Blockierung Die proteinfreie Blockierung durch Anwendung von BlueBlock PF ist der beste Weg, um möglichst untergrundfreie Blots zu erhalten. BlueBlock PF

I. Antikörper-Nachweis (HCP AB, Anti IgG HRP) Detektieren Sie Ihre membrangebundenen Proteine mit primären und sekundären Antikörpern. Ihre Antikörper

J. Chemilumineszenz-Detektion Hochsensitiver verstärkter Chemilumineszenz-Kit für die Detektion von HRP-markierten Antikörpern. SERVALight CL HRP WB Substrate Kits

K. Imaging Nachweis von HCP-spezifischen, Antikörper-markierten Proteinen mit einem Fluoreszenz- und Chemilumineszenz-Imaging-System. Die Auswertung erfolgt dann mit einer 2D-Software, auch hier kann SERVA behilflich sein.