Western Blotting

Für die Analyse werden Proteine meistens mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt. Eine weitere Charakterisierungsmethode bildet der anschließende Western Blot, gefolgt von einer Immundetektion. Dazu werden Proteine durch Elektrotransfer geblottet. Der Transfer kann entweder mittels Semi-dry oder Tank-Blotting erfolgen.

Blotting 305 x 120

Semi-dry Blotting

  • Erfolgt in der Regel mit einem diskontinuierlichen Puffersystem
  • Für effizienten und schnellen Proteintransfer (innerhalb von 15 min): SERVA Xpress Blotting mit einem speziellen Puffersystem und Blotting Fleeces
  • Ermöglicht den gleichmäßigen Transfer von großen und kleinen Proteinen

Tank Blotting

  • Erfolgt in der Regel mit Towbin-Puffer
  • Kleine Proteine werden schneller geblottet als große

Als Transfermembranen können sowohl Nitrocellulose (NC)- als auch PVDF-Membranen verwendet werden.

Nitrocellulose (NC) - Häufig für Routineapplikationen eingesetzt

  • Bindungskapazität: 80 - 120 mg/cm2
  • Geringer Hintergrund
  • Geringe mechanische Stabilität, falls nicht verstärkt
  • Proteinbindung ist abhängig von der Methanol-Konzentration
  • Für Proteine, DNA, RNA

PVDF – Bessere Transferergebnisse als NC aufgrund der höheren Bindungskapazität

  • Bindungskapazität: 125 - 250 mg/cm2
  • Hydrophob
  • Hohe mechanische Stabilität
  • Für Proteine

Der Nachweis der Membran-gebundenen Proteine erfolgt in der Regel mit Meerrettich-Peroxidase (HRP)- oder alkalischer Phosphatase (AP)-markierten Antikörpern.

Antigen-gebundene Antikörper werden anschließend durch eine chemische Reaktion des Enzyms mit dem jeweiligen Substrat detektiert, da hierbei ein Chemilumineszenz- oder kolorimetrisches Signal entsteht.

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