Herstellung des Semi-dry Transferpuffers
Proteintransfer mittels Semi-Dry Blotting
- Schneiden Sie die Transfermembran und vier Blatt Whatmann 3 MM Papier auf Gelgröße (7 x 8 cm).
- Äquilibrieren Sie die Membran in Transferpuffer bzw. bei der Verwendung von PVDF-Membranen zunächst für 2 Minuten in Methanol und anschließend für weitere 5 Minuten in Transferpuffer.
- Befeuchten Sie die vier Blatt Whatmann 3 MM Papier ebenfalls mit Transferpuffer.
- Entnehmen Sie das Gel der Kassette (siehe Abschnitt 2) und äquilibrieren Sie das Gel für 5 Minuten in Transferpuffer.
- Bauen Sie das Transfersandwich analog zum Tankblot-Sandwich auf, und platzieren Sie es im Semi-Dry-Blotter.
- Der Transfer erfolgt bei Raumtemperatur mit 1,5 mA/cm2 Gelfläche für ca. 1 Stunde (für Standardmarkerproteine).
Beim Transfer von unterschiedlich großen Proteinen empfiehlt sich der Einsatz eines diskontinuierlichen Blotting-Puffersystems.
Transferpuffer:
Anodenpuffer 1: | 300 mM Tris, pH 9,5 |
Anodenpuffer 2: | 30 mM Tris, pH 9,5 |
Kathodenpuffer: | 40 mM 6-Aminohexan Säure, 20 % (v/v) Methanol |
Blotting-Sandwich:
Anode (+)
- 2 Filterpapiere angefeuchtet mit Anodenpuffer 1
- 2 Filterpapiere angefeuchtet mit Anodenpuffer 2
- Transfer-Membran
- 3 Filterpapiere angefeuchtet mit Kathodenpuffer
Kathode (-)